CRISPR
Definición de CRISPR
Las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) son tramos cortos y repetidos de ADN que se encuentran en la mayoría de las arqueas y muchas bacterias. CRISPR y las proteínas asociadas a CRISPR (Cas) forman un sistema inmunológico adaptativo que protege contra elementos genéticos extraños como virus, plásmidos y transposones. El sistema CRISPR/Cas9 también proporciona la base para una herramienta de edición del genoma que se puede utilizar para modificar genes de forma permanente de una manera específica y dirigida.
Características de CRISPR Loci
Los loci CRISPR están compuestos por una secuencia líder rica en AT seguida de múltiples nucleótidos cortosrepeticiones separadas por regiones espaciadoras. Muchas de las repeticiones son palindrómicas, con estructura secundaria de horquilla de ARN predicha, mientras que otras carecen de simetría y se predice que forman ARN no estructurado. Las repeticiones se conservan dentro de un locus CRISPR, mientras que los espaciadores son muy variables y corresponden al ADN adquirido por exposición a ADN extraño, como virus y plásmidos. La longitud de las repeticiones y espaciadores CRISPR varía; las repeticiones tienen una longitud de 23 a 55 pares de bases y los espaciadores tienen una longitud de 21 a 72 pares de bases. Las matrices CRISPR generalmente se encuentran adyacentes a grupos de genes Cas. Los genes Cas codifican una amplia variedad de proteínas que tienen dominios funcionales que se encuentran en helicasas, nucleasas, polimerasas y otras proteínas de unión a nucleótidos. Las proteínas Cas tienen funciones para adquirir ADN espaciador, procesamiento de ARN y unión y escisión de la diana.El genoma del organismo puede contener uno o varios loci CRISPR (se han observado hasta 18 en un solo organismo).
Clases y tipos de CRISPR
Hay dos clases de sistemas CRISPR/Cas, denominados Clase 1 y Clase 2. Los sistemas de Clase 1 utilizan múltiples proteínas Cas para escindir el ADN extraño, mientras que los sistemas de Clase 2 usan una única proteína Cas. Las clases se dividen en tipos; La clase 1 contiene los tipos I, III y IV, y la clase 2 contiene los tipos II, V y VI. Los tipos se definen por un gen que generalmente se encuentra solo dentro de ese tipo, así como por los genes Cas adicionales presentes. Los tipos se dividen en 19 subtipos.
Función y mecanismo de CRISPR en procariotas
CRISPR proporciona a los procariotas inmunidad adquirida contra elementos genéticos invasores. Estos loci incorporan material genético de virus y plásmidos y lo utilizan para apuntar a elementos genéticos extraños de una manera específica de secuencia. Los pasos involucrados en la protección contra elementos genéticos extraños usando el sistema CRISPR/Cas son la adquisición de ADN espaciador del virus invasor; la biogénesis de ARN CRISPR (ARNcr), que permitirá el reconocimiento de ADN extraño, y la interferencia, en la que el ADN invasivo es reconocido y escindido.
Adquisición de Spacer DNA
Cuando una célula procariota es invadida por un virus, se toman muestras de porciones del ADN viral y se incorporan a las regiones espaciadoras del locus CRISPR. Las enzimas nucleasa Cas1 y Cas2 están involucradas en la adquisición de espaciadores en E. coli y probablemente en todos los sistemas CRISPR/Cas, ya que son las únicas proteínas Cas que se encuentran conservadas en todos los sistemas. El ADN que se muestrea e incorpora en los loci CRISPR como espaciadores puede ubicarse junto a los motivos adyacentes al protoespaciador (PAM) dentro del genoma viral; Los PAM son importantes en la selección de ácidos nucleicos extraños en sistemas de tipo I y tipo II. Los espaciadores generalmente se agregan al lado de la secuencia líder, aunque el nuevo espaciador también se puede insertar aleatoriamente en la matriz de espaciadores repetidos.
Biogénesis de crRNA
Tras la incorporación de ADN extraño en un locus CRISPR, la secuencia CRISPR se transcribe y procesa en pequeños crRNA que interfieren. La matriz de espaciadores repetidos se transcribe inicialmente en una sola transcripción, que luego es procesada por proteínas Cas en crRNA, que luego sirven como guía para apuntar a ácidos nucleicos extraños. La biogénesis de crRNA difiere en diferentes sistemas CRISPR. En ciertos sistemas de tipo I, las proteínas Cas se escinden en el borde de los bucles de tallo en la transcripción larga para producir ARNcr más pequeños. En los sistemas de tipo II, se transcribe un crRNA trans-activador (tracrRNA) que es complementario a las repeticiones CRISPR, lo que resulta en la formación de RNA bicatenario (dsRNA). El dsRNA es escindido por RNaseIII para producir crRNAs.
Interferencia
Durante la etapa de interferencia, los crRNA se asocian con las proteínas Cas para formar un complejo que reconoce, ataca y destruye el material genético viral. Los pares de bases de crRNA se emparejan con la secuencia complementaria en el ADN viral, marcándolo para su destrucción. También puede ser necesario el reconocimiento de la secuencia de PAM para el reconocimiento del ADN extraño. En los sistemas de tipo II, Cas9 lleva a cabo el paso de interferencia utilizando un crRNA y un tracrRNA que le permite reconocer el ADN extraño. Además de reconocer las secuencias diana, Cas9 tiene actividad endonucleasa y escinde el ADN extraño.
La figura muestra cómo el sistema CRISPR/Cas se defiende contra elementos genéticos extraños en procariotas.
Sistema CRISPR/Cas9 como herramienta de edición del genoma
El sistema CRISPR/Cas se ha aprovechado como técnica de biología molecular para la edición selectiva del genoma. La edición del genoma se realiza mediante el sistema CRISPR/Cas9. La proteína Cas9 es una endonucleasa de ADN que utiliza un ARN guía para apuntar y escindir el ADN. Native Cas9 utiliza un ARN guía compuesto de ARNcr y ARN CRISPR trans-activador (tracrRNA); a los efectos de la edición del genoma, este sistema se simplificó fusionando crRNA y tracrRNA para formar un único RNA guía. El sistema también puede incluir una plantilla de reparación, que se utiliza en la reparación del ADN a través de no homólogos unión final o reparación dirigida por homología. Al alterar la secuencia del ARN guía, el sistema CRISPR/Cas9 se puede utilizar para apuntar a cualquier secuencia de ADN y derribar; activar o mutar la secuencia deseada.
Los componentes del sistema CRISPR/Cas9 a menudo se incorporan a un plásmido que se usa para transfectar células para la edición del genoma. Se pueden realizar varios cambios simultáneamente; en un caso, se modificaron 62 genes a la vez.
Activación y represión genética
CRISPR que carece de actividad nucleasa (denominado dCas9) se puede usar para apuntar a una secuencia específica para activación o supresión. Al eliminar la capacidad de cortar el ADN, el sistema CRISPR/Cas9 se puede utilizar para apuntar a genes sin escindirlos. Cas9 que carece de actividad nucleasa sola bloquea la transcripción en células bacterianas; en células de mamífero se incorporan proteínas adicionales. Los factores de transcripción también se pueden acoplar a Cas9, lo que permite la activación de genes diana.
Alterando la secuencia genética
Se puede incluir una plantilla de reparación de ADN en el sistema CRISPR/Cas9 que permite incorporar esta secuencia de ADN en la ubicación deseada. La plantilla de reparación se extiende más allá de la ubicación de la sección de ADN escindida. Una vez que se introduce la rotura del ADN; la maquinaria de reparación del ADN de la célula utiliza la plantilla para reparar el ADN, alterando así permanentemente la secuencia del ADN.
Aplicaciones CRISPR
La tecnología CRISPR se puede utilizar para realizar alteraciones genéticas precisas en diversos tipos de células y organismos, incluidos ratones, plantas, peces y células humanas. CRISPR se puede utilizar para generar modelos animales de enfermedad al anular o dirigirse a un gen de interés. También se puede usar para generar líneas celulares que contienen mutaciones que causan enfermedades y se puede usar para estudiar los mecanismos moleculares de la enfermedad. Los CRISPR también tienen aplicaciones terapéuticas prometedoras; pueden ser eficaces para atacar virus como el herpesvirus y prevenir su replicación en humanos, se han utilizado para tratar trastornos genéticos en animales y han sido aprobados para ensayos clínicos en el tratamiento del cáncer. Además de las aplicaciones biomédicas, también se puede utilizar para diseñar cepas de levadura productoras de biocombustible, así como cultivos alimentarios.
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