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Eastern Blot

Definición de Eastern Blot

Eastern blot es una técnica de biología molecular que se utiliza para detectar modificaciones postraduccionales en proteínas y la presencia de componentes como lípidos y carbohidratos.

  • El eastern blot se descubrió como una extensión de la técnica más popular, western blot.
  • Eastern blot se realiza principalmente para detectar la presencia de biomoléculas en diferentes proteínas, que se pueden utilizar para estudiar las diferencias en las modificaciones postraduccionales en diferentes especies.
  • El principio y el procedimiento del método son similares en todas las técnicas de transferencia; sin embargo, la molécula o partícula a detectar puede diferir.
  • El eastern blot se ha modificado ligeramente para formar una nueva forma de técnica de transferencia llamada transferencia occidental lejana, que se utiliza para estudiar los lípidos que se separan mediante cromatografía.

Principio de Eastern Blot

  • El principio del eastern blot es similar al principio de otras técnicas de transferencia.
  • Es una técnica de inmunotransferencia que depende de la especificidad entre la proteína de interés y una sonda para identificar la biomolécula de interés en una mezcla de diferentes moléculas.
  • En el caso del eastern blot, las proteínas se someten a electroforesis en gel de poliacrilamida para separarlas de la mezcla.
  • A continuación, las proteínas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa o nailon, donde las moléculas diana se detectan mediante su interacción específica con las sondas.
  • La identificación de la interacción se puede realizar mediante el uso de una sonda radiactiva o mediante el uso de una molécula etiquetada secundaria como en el caso de ELISA.
  • La transferencia Eastern, como todas las demás técnicas de transferencia, se basa en las interacciones antígeno-anticuerpo donde la especificidad y el grado de interacción determinan el resultado.
  • La transferencia Eastern es similar a la transferencia de lectina, ya que ambas se utilizan principalmente para la detección de epítopos de carbohidratos en proteínas y lípidos.
  • Para la detección de compuestos moleculares más pequeños es esencial, ya que la detección de estas moléculas no se puede lograr mediante inmunotinción.

Requisitos

Los siguientes son los requisitos para la transferencia:

  1. Placa de cromatografía de capa fina
  2. Membrana de transferencia
  3. NaIO 4 solución
  4. Solución secante
  5. Na 2 CO 3 / NaHCO 3
  6. Plato de acero inoxidable

Procedimiento de Eastern Blot

El siguiente es el protocolo para su realización:

  1. La placa de TLC desarrollada después de la cromatografía se cubre con la membrana de PVDF para transferir el contenido de la placa a la membrana, ya sea presionando o calentando.
  2. La transferencia de componentes de la placa de TLC a la membrana también se puede obtener pasando corriente eléctrica a través de la estructura.
  3. Luego, la membrana se trata con perioduro de sodio para fijar los componentes en la membrana. Se incuba en la solución durante 1 hora y se lava con agua.
  4. La membrana se sumerge en una solución de BSA en condiciones alcalinas ( tampón Na 2 CO 3 / NaHCO 3 ) para preparar el conjugado hapteno-BSA en la membrana. 
  5. Se bloquea con leche desnatada al 5% / PBS durante 3 horas y se lava con PBS. La membrana se trató con MAb, que detecta el hapteno.
  6. La interacción entre el MAb y el hapteno forma la base del eastern blot para su detección.
  7. A continuación, el MAb puede detectarse mediante la adición de un segundo anticuerpo marcado con peroxidasa.
  8. Finalmente, se agrega un sustrato a la membrana, que ayuda en la visualización del segundo anticuerpo mediante tinción.

Interpretación de resultados 

  • El resultado del eastern blot depende del tipo de marcador utilizado en el segundo anticuerpo.
  • Un resultado positivo está indicado por la aparición de color o radiactividad.
  • El resultado negativo está indicado por la falta de color o radiactividad.

Aplicaciones de Eastern Blot

  • La aplicación más importante es el análisis de modificaciones postraduccionales en proteínas.
  • La técnica se ha utilizado para identificar y purificar diferentes productos vegetales.
  • El eastern blot también permite la detección de modificaciones en proteínas de diferentes orígenes.
  • También ayuda a estudiar la naturaleza de las interacciones entre diferentes moléculas mediante el uso de ligandos.
  • La transferencia Eastern se ha utilizado ampliamente para comparar modificaciones en proteínas obtenidas de diferentes especies bacterianas.
  • También se utiliza para detectar epítopos de carbohidratos en diferentes proteínas.
Modificaciones postraduccionales de proteínas
Modificaciones postraduccionales de proteínas

Limitaciones de Eastern Blot

  • La técnica es complicada y contiene varios pasos propensos a errores. También requiere personal capacitado para su uso.
  • La técnica requiere el uso de una cantidad significativa de muestra, lo que puede ser un problema en el caso de producciones con poco rendimiento.
  • La cuantificación precisa de las proteínas y biomoléculas es difícil con un eastern blot.
  • En algunos casos, la interacción entre la sonda y las biomoléculas puede resultar en la destrucción de la estructura terciaria de la proteína.
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