Electroforesis en gel

La electroforesis en gel es un procedimiento que se utiliza para separar moléculas biológicas por tamaño. La separación de estas moléculas se logra colocándolas en un gel con poros pequeños y creando un campo eléctrico a través del gel. Las moléculas se moverán más rápido o más lento según su tamaño y carga eléctrica.

Descripción general de la electroforesis en gel

El proceso de electroforesis en gel funciona porque las moléculas cargadas negativamente se alejan del polo negativo de la corriente eléctrica y las moléculas más pequeñas se mueven más rápido que las moléculas más grandes. Por lo tanto, se logra una separación de tamaño dentro del conjunto de moléculas que atraviesan el gel. El gel funciona de manera similar a un tamiz que separa las partículas por tamaño. La electroforesis trabaja para mover las partículas, utilizando su carga eléctrica inherente, a través del tamiz.

Cuando los investigadores intentan distinguir entre diferentes segmentos de ADN, por ejemplo, el proceso es simple. Las muestras se cargan en canales al comienzo del gel. Cada molécula de ADN tiene la misma carga (-1), porque el ADN está formado por los mismos 4 nucleótidos y siempre lleva una carga ligeramente negativa independientemente de su tamaño. Por lo tanto, cada molécula de ADN tendrá la misma fuerza para atravesar el gel.

Sin embargo, el tamaño de cada molécula dificulta su avance a través del gel. Las moléculas grandes golpean partes de la matriz del gel y se ralentizan. Pequeñas moléculas de ADN pueden deslizarse entre los diversos componentes de la matriz del gel y rápidamente llegar al otro lado del gel. Después de una cierta cantidad de tiempo, las moléculas de ADN teñidas se pueden ver agregando en diferentes áreas del gel, según la distancia que se movieron durante la electroforesis en gel. Esto permite a los investigadores identificar los segmentos y comparar el ADN de diferentes organismos.

¿Para qué se utilizan las electroforesis en gel?

El propósito de la electroforesis en gel es visualizar, identificar y distinguir moléculas que han sido procesadas por un método previo como PCR, digestión enzimática o una condición experimental. A menudo, las mezclas de ácidos nucleicos o proteínas que se recogen de un experimento / método anterior se pasan por electroforesis en gel para determinar la identidad o diferenciar entre moléculas.

Pasos de electroforesis en gel

Los pasos generales involucrados en un protocolo común de electroforesis en gel de ADN:

1. Preparación de las muestras para su ejecución

El ADN se aísla y se procesa previamente (por ejemplo, PCR, digestión enzimática) y se prepara en solución con un tinte azul básico para ayudar a visualizar el movimiento de la muestra a través del gel.

2. Se prepara una solución de gel de agarosa TAE.

El tampón TAE proporciona una fuente de iones para configurar el campo eléctrico durante la electroforesis. La concentración de peso a volumen de agarosa en tampón TAE se usa para preparar la solución. Por ejemplo, si se requiere un gel de agarosa al 1%, se agrega 1 g de agarosa a 100 ml de TAE. El porcentaje de agarosa utilizado está determinado por el tamaño que se espera que tenga el ADN. Si se busca separar un grupo de bandas de ADN de menor tamaño (<500 pb), se prepara un gel de agarosa de mayor porcentaje (> 1%). El mayor porcentaje de agarosa crea un tamiz más denso para aumentar la separación de pequeñas diferencias en la longitud del ADN. La solución de agarosa-TAE se calienta para disolver la agarosa.

3. Colada del gel

La solución de agarosa TAE se vierte en una bandeja de colada que, una vez que la solución de gel se ha enfriado y solidificado, crea una placa de gel con una fila de pocillos en la parte superior.

4. Configuración de la cámara de electroforesis

El gel sólido se coloca en una cámara llena de tampón TAE. El gel se coloca de modo que los pocillos de la cámara estén más cerca del electrodo negativo de la cámara.

5. Carga del gel

Los pocillos de la cámara de gel se cargan con las muestras de ADN y, por lo general, también se carga una escalera de ADN como referencia para los tamaños.

6. Electroforesis

Los cables negativo y positivo están conectados a la cámara y a una fuente de alimentación donde se establece el voltaje. Al encender la fuente de alimentación se establece el campo eléctrico y las muestras de ADN cargadas negativamente comenzarán a migrar a través del gel y alejarse del electrodo negativo hacia el positivo.

7. Detener la electroforesis y visualizar el ADN

Una vez que el tinte azul en las muestras de ADN ha migrado a través del gel lo suficiente, se apaga la fuente de alimentación y se retira el gel y se coloca en una solución de bromuro de etidio. El bromuro de etidio se intercala entre el ADN y es visible a la luz ultravioleta. A veces, se añade bromuro de etidio directamente a la solución de gel de agarosa en el paso 2. El gel teñido con bromuro de etidio se expone luego a luz ultravioleta y se toma una fotografía. Las bandas de ADN se visualizan en cada carril correspondiente a un pozo de la cámara. También se visualiza la escalera de ADN que se cargó y se puede estimar la longitud de las bandas de ADN. En la figura siguiente se ofrece un ejemplo.

Tipos de electroforesis en gel

Hay dos tipos de electroforesis en gel: nativa y desnaturalizante. La electroforesis en gel nativo generalmente intenta mantener el ARN o la proteína en su estructura nativa mientras lo hace pasar por el gel. La electroforesis en gel desnaturalizante intenta reducir el ARN o la proteína a su estructura más lineal antes o durante la electroforesis en gel.

La desnaturalización del ARN o la proteína se logra añadiendo un agente reductor a la muestra, gel y / o tampón. El agente reductor separa los enlaces dentro del ARN o la molécula de proteína y, por lo tanto, reduce su estructura secundaria. La estructura secundaria de una proteína o ARN influirá, de manera no lineal, en la rapidez con la que migra a través de un gel. Sin embargo, una forma lineal desnaturalizada de ARN o proteína migrará proporcionalmente a su tamaño lineal (pares de bases o kilo Daltons). La electroforesis en gel desnaturalizante suele ser más precisa para la identificación del tamaño, mientras que la electroforesis en gel nativo se usa generalmente para identificar complejos de proteínas más grandes.

Ejemplos de electroforesis en gel

La electroforesis en gel de agarosa TAE se usa más comúnmente para el ADN.
TBE y PAGE desnaturalizante (electroforesis en gel de poliacrilamida) son comunes para la separación de ARN.
SDS PAGE es una electroforesis en gel desnaturalizante comúnmente utilizada para la identificación y separación de proteínas.

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