PCR en tiempo real
¿Qué es la PCR en tiempo real?
- Es una técnica utilizada para monitorear el progreso de una reacción de PCR en tiempo real.
- Al mismo tiempo, se puede cuantificar una cantidad relativamente pequeña de producto de PCR (ADN, ADNc o ARN).
- Se basa en la detección de la fluorescencia producida por una molécula informadora que aumenta a medida que avanza la reacción.
- También se conoce como reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), que es una técnica de laboratorio de biología molecular basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
- qPCR es una técnica poderosa que permite la amplificación exponencial de secuencias de ADN.
- Una reacción de PCR necesita un par de cebadores que sean complementarios a la secuencia de interés. Los cebadores son extendidos por la ADN polimerasa.
- Las copias producidas después de la extensión, los denominados amplicones, se vuelven a amplificar con los mismos cebadores, lo que conduce a una amplificación exponencial de las moléculas de ADN.
- Sin embargo, después de la amplificación, se usa electroforesis en gel para analizar los productos de PCR amplificados y esto hace que la PCR convencional consuma mucho tiempo; ya que la reacción debe finalizar antes de proceder con el análisis post-PCR. La PCR en tiempo real soluciona este problema.
- El término «en tiempo real» denota que puede monitorear el progreso de la amplificación cuando el proceso está en curso, en contraste con el método de PCR convencional donde el análisis es posible solo después de que se completa el proceso.
Terminología de PCR
| Reacción en cadena de la polimerasa | PCR |
| Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa | RT-PCR |
| Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real | qPCR |
| Técnica combinada RT-PCR / qPCR | qRT-PCR |
Imagen creada con biorender.com
Principio de PCR en tiempo real
Este mismo principio de amplificación de la PCR se emplea en la PCR en tiempo real. Pero en lugar de mirar las bandas en un gel al final de la reacción, el proceso se monitorea en “tiempo real”. La reacción se coloca en una máquina de PCR en tiempo real que observa cómo ocurre la reacción con una cámara o detector.
Aunque se utilizan muchas técnicas diferentes para controlar el progreso de una reacción de PCR, todas tienen algo en común. Todos ellos relacionan la amplificación del ADN con la generación de fluorescencia que puede detectarse simplemente con una cámara durante cada ciclo de PCR. Por lo tanto, a medida que aumenta el número de copias de genes durante la reacción, también lo hace la fluorescencia, lo que indica el progreso de la reacción.
Pasos de la PCR en tiempo real (protocolo)
Fuente de la imagen: SMOBIO Technology, Inc.
El procedimiento de trabajo se puede dividir en dos pasos:
A. Amplificación
La incubación a alta temperatura se utiliza para «fundir» el ADN bicatenario en cadenas simples y aflojar la estructura secundaria en el ADN monocatenario. Normalmente se utiliza la temperatura más alta que puede soportar la ADN polimerasa (normalmente 95 ° C). El tiempo de desnaturalización se puede aumentar si el contenido de la plantilla de GC es alto.
- Recocido
Durante la hibridación, las secuencias complementarias tienen la oportunidad de hibridar, por lo que se usa una temperatura apropiada que se basa en la temperatura de fusión calculada (Tm) de los cebadores (5 ° C por debajo de la Tm del cebador).
- Extensión
A 70-72 ° C, la actividad de la ADN polimerasa es óptima y la extensión del cebador se produce a velocidades de hasta 100 bases por segundo. Cuando un amplicón en PCR en tiempo real es pequeño, este paso a menudo se combina con el paso de recocido usando 60 ° C como temperatura.
B. Detección
- La detección se basa en tecnología de fluorescencia.
- La muestra se mantiene primero en el pozo adecuado y se somete a un ciclo térmico como en la PCR normal.
- Sin embargo, la máquina en la PCR en tiempo real se somete a una fuente de tungsteno o halógeno que hace que el marcador fluorescente se agregue a la muestra y la señal se amplifica con la amplificación del número de copias de la muestra de ADN.
- La señal emitida es detectada por un detector y enviada a la computadora después de la conversión a una señal digital que se muestra en la pantalla.
- La señal se puede detectar cuando sube el nivel de umbral (nivel de detección más bajo del detector).
Marcadores de fluorescencia utilizados en PCR en tiempo real
Hay muchos marcadores diferentes que se utilizan en la PCR en tiempo real, pero los más comunes incluyen:
- Sonda Taqman.
- SYBR Verde.
Sonda Taqman
- Es una sonda de hidrólisis que lleva un colorante indicador, a menudo fluoresceína (FAM) en su extremo 5 ‘y un inhibidor de tetrametilrodamina (TAMRA), unido al extremo 3’ del oligonucleótido.
- En condiciones normales, la sonda permanece enrollada sobre sí misma llevando el tinte de fluorescencia cerca del extintor, que inhibe o apaga la señal fluorescente del tinte.
- El oligonucleótido de la polimerasa Taq tiene una región homóloga con el gen diana y, por tanto, cuando la secuencia diana está presente en la mezcla, se une al ADN de la muestra.
- A medida que la taqpolimerasa comienza a formar una nueva cadena de ADN en la etapa de extensión, provoca la degradación de la sonda por la actividad nucleasa del extremo 5 ‘y la fluoresceína se separa del extintor como resultado de lo cual se genera la señal de fluorescencia.
- A medida que continúa este procedimiento, en cada ciclo aumenta el número de moléculas de señal, provocando el aumento de la fluorescencia que se relaciona positivamente con la amplificación de la diana.
SYBR Verde
- Este es un tinte que emite una señal fluorescente prominente cuando se une al surco menor del ADN, de manera inespecífica.
- También se pueden utilizar otros tintes fluorescentes como el bromuro de etidio o el naranja de acridina, pero es mejor utilizar SYBR Green por su mayor intensidad de señal.
- SYBR Green es más preferido que la sonda Taqman, ya que puede proporcionar información sobre cada ciclo de amplificación, así como sobre la temperatura de fusión que no se obtiene de la sonda Taqman.
- Sin embargo, su desventaja es la falta de especificidad en comparación con Taqman Probe.
Ventajas
Tiene muchas ventajas sobre la PCR normal:
- Da una mirada a la reacción que ayuda a decidir qué reacciones han funcionado bien y cuáles han fallado.
- La eficiencia de la reacción se puede calcular con precisión.
- No es necesario procesar el producto de PCR en un gel después de la reacción, ya que el análisis de la curva de fusión sirve para ese propósito.
- Los datos de la PCR en tiempo real se pueden utilizar para realizar un análisis verdaderamente cuantitativo de la expresión génica. En comparación, la PCR pasada de moda solo era semicuantitativa en el mejor de los casos.
- PCR más rápido de lo normal.
- Menor complejidad en la cuantificación de sample.etc.
Así, a diferencia de la PCR preparativa ordinaria, la PCR en tiempo real permite determinar automáticamente el éxito de una reacción de PCR múltiple después de unos pocos ciclos, sin un análisis por separado de cada reacción, y evita el problema de los “falsos negativos”.
Aplicaciones
- Análisis de expresión genética
- Investigación sobre el cáncer
- Investigación de drogas
- Diagnóstico y manejo de enfermedades
- Cuantificación viral
- Pruebas de alimentos
- Alimentos transgénicos
- Cría de animales y plantas
- Número de copia del gen
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