Glutamina sintetasa
La glutamina sintetasa (GS) es una enzima responsable de catalizar la reacción que sintetiza la glutamina a partir del glutamato y el amoníaco, como se muestra en la Figura 1 a continuación. Además, GS cataliza la reacción inversa de glutamato a glutamina, la «reacción de transferencia de 7-glutamilo» que transfiere el 7-glutamilo de glutamina a hidroxilamina produciendo hidroxamato de 7-glutamilo y más. Este artículo se centrará en la síntesis de glutamato en glutamina.
En última instancia, GS regula los niveles de nitrógeno en moléculas como el ADN y los aminoácidos; toma el nitrógeno de la glutamina producida en la reacción de síntesis y lo entrega a moléculas deficientes en nitrógeno. GS también podría ralentizar la transferencia de nitrógeno a moléculas ricas en nitrógeno, así como regular la producción de ciertos aminoácidos y nucleótidos, como el monofosfato de adenosina (AMP), histidina y alanina, al reducir la síntesis de estas moléculas cuando están en exceso. GS está presente tanto en plantas como en animales. En las plantas, GS desintoxica el amoníaco y en los animales recicla moléculas de neurotransmisores de aminoácidos y desintoxica el amoníaco.
El GS humano está presente tanto en el cerebro como en el hígado. En el cerebro humano, GS se encuentra con mayor frecuencia en los astrocitos, células gliales en forma de estrella en el sistema nervioso. Los astrocitos son responsables de proteger a las neuronas contra la excitotoxicidad (daño o muerte de las células nerviosas por estimulación de neurotransmisores). Esta protección se logra mediante la conversión del exceso de amoníaco, que es tóxico, y el glutamato, que es neurotóxico, en glutamina, catalizada por GS. Tanto en el cerebro como en el hígado, el papel del GS humano es similar al GS bacteriano en que el GS humano elimina el amoníaco tóxico. El mal funcionamiento de esta enzima en el hígado puede provocar cirrosis hepática, hepatitis crónica B y C, algunos tipos de hiperplasia y algunas neoplasias. En cuanto al GS humano en el cerebro, monitorea la toxicidad del glutamato convirtiendo el glutamato en glutamina, que es menos neurotóxico (Figura 1). El mal funcionamiento de GS en el cerebro puede conducir a enfermedades neurológicas como Alzheimer, epilepsia, glioblastoma multiforme, ansiedad y depresión.
Figura 1, Reacción de glutamato a glutamina. La reacción de glutamato con amoníaco (NH 3 ) y trifosfato de adenosina (ATP) para producir glutamina, difosfato de adenosina (ADP), fosfato (P i ), y los iones de hidrógeno (H + ).
Si bien la Figura 1 demuestra la reacción general del glutamato para formar glutamina, se propone que esta reacción se produzca en dos pasos, con un intermedio tetraédrico. El mecanismo de dos pasos propuesto se muestra en la Figura 2 a continuación.
Figura 2, Mecanismo de dos pasos. Mecanismo propuesto de dos pasos para la síntesis de glutamato y amoníaco para producir glutamina.
La estructura general del GS bacteriano es un dodecámero formado por dos anillos hexaméricos de subunidades enfrentados. Hay doce sitios activos, uno en cada monómero. La figura 3 a continuación ilustra la estructura de la glutamina sintetasa bacteriana.
Figura 3, GS bacteriana. La estructura de la glutamina sintetasa bacteriana. La unidad biológica funcional es un homododecomer (12 subunidades idénticas). El área resaltada en verde representa una de las doce subunidades. (a) La vista superior muestra el anillo hexamérico y un lado del dodecamer. (b) La vista lateral muestra los dos anillos hexaméricos cara a cara. Esta figura se creó a partir de PDB 1fpy utilizando el software UCSF Chimera.
Cada sitio activo puede describirse como un bifunnel en el que el ATP se une en la parte superior y el glutamato en la parte inferior. Dos cationes metálicos se encuentran en el centro de cada sitio activo. La enzima es funcional con Mg 2+ o Mn 2+ en el sitio activo, sin embargo, Mn 2+ es más común a pesar de que ralentiza ligeramente la actividad de la enzima GS. La catálisis de 5 GS es más rápida con Mg 2+, sin embargo, GS selecciona Mn 2+ porque se une a la enzima con mayor afinidad. La figura 4 a continuación muestra la estructura de un único sitio activo de GS. Hay múltiples ligandos unidos en los sitios activos de GS. El Mn 2+ El ion metálico ilustrado a continuación se une a dos cadenas laterales de aminoácidos de glutamato, una cadena lateral de histidina y dos moléculas de agua. El ion metálico azul Mn 2+ que se ilustra a continuación se une a tres cadenas laterales de aminoácidos de glutamato y dos moléculas de agua. La Figura 4 también ilustra que el Mn 2+ rosado se une a una molécula de difosfato de adenosina (ADP), que es un sustrato común para GS, y que el ion metálico azul se une a una molécula de fosfinotricina (PPT), que es un inhibidor de GS que se une a la enzima en una posición similar a la del sustrato de aminoácidos (glutamato o glutamina). Esto demuestra que, aunque PPT y ADP no siempre están unidos en el sitio activo, los iones metálicos en GS son capaces de unirse a seis ligandos cada uno. En última instancia, GS es geométricamente flexible, lo que permite que los sustratos se unan y se liberen en / desde los sitios activos; La función catalítica depende de su estructura. Este sitio activo no podría funcionar si el ion metálico estuviera saturado coordinadamente, lo que significa que todos los sitios de coordinación están ocupados. El sistema debe tener una posición de coordinación intercambiable para que el ligando del sustrato pueda interactuar con el metal, reaccionar y luego permitir que el producto sea liberado o intercambiado por un nuevo sustrato. Se sabe que GS tiene tres sitios de unión de sustrato distintos: uno para el nucleótido, otro para el ión amonio y otro para los aminoácidos. Se une a sus sustratos cerca de sus dos sitios de iones metálicos, sin embargo, el orden de unión sigue sin estar claro. La unión del sustrato de aminoácidos es muy específica en GS bacteriana y eucariota, mientras que el sitio de unión de nucleótidos varía mucho más en lo que puede unirse. Esto condujo a la determinación de que los sitios de unión de nucleótidos podrían usarse para el diseño de fármacos diana.
Figura 4, GS bacteriana. El recuadro muestra un agrandamiento de un único sitio activo de GS bacteriano en el que los iones de manganeso son los centros de iones metálicos. El ion de manganeso rosa es el ion metálico de baja afinidad que ayuda en la estabilización del sitio activo de GS y la unión del quelato de Mn-ATP. En la figura anterior, el ion rosa Mn 2+ está unido a dos cadenas laterales de aminoácidos de glutamato, una cadena lateral de histidina, una molécula de difosfato de adenosina ( ADP), que es un sustrato común que se introduce en el sistema. Además, la molécula está unida a dos moléculas de agua, que no se muestran en la imagen. Esto trae la geometría de iones metálicos del Mn 2+ rosa a octaédrico (seis ligandos). El segundo ion metálico de manganeso, de color azul, se considera el cofactor catalítico, que proporciona estructura y estabilización a los intermedios en el sitio activo. Este ion Mn 2+ está unido a tres cadenas laterales de aminoácidos de glutamato y fosfinotricina ( PPT), que es un inhibidor de GS que también se introdujo en el sistema. Nuevamente, el Mn 2+ azul también está unido a dos moléculas de agua, no representadas, lo que le da una geometría octaédrica también. Esta figura se creó a partir de PDB 1fpy utilizando el software UCSF Chimera.
Si bien este artículo se centrará en la GS bacteriana y cómo funciona, también es interesante señalar que existe otra forma de GS que se encuentra en los seres humanos. La estructura de la GS humana varía ligeramente de la GS bacteriana. Consiste en una estructura homodecámero organizada en dos anillos pentaméricos (a diferencia de los anillos hexaméricos) en los que el sitio activo aún se encuentra entre monómeros adyacentes, formando un bifunnel. Esto se ilustra en las Figuras 5 y 6 a continuación. También es diferente del GS bacteriano en que hay tres iones metálicos en el sitio activo, en lugar de dos. Si bien al principio se pensó que las propiedades funcionales y estructurales del sitio activo de GS se conservaban en mamíferos y plantas, estudios posteriores encontraron que las estructuras cristalinas de GS humana en realidad contenían tres iones metálicos en cada sitio activo.
Figura 5, GS humana. (a) Vista superior de la estructura de la glutamina sintetasa humana, muestra el anillo pentamérico y un lado del homodecámero (b) Vista lateral de la estructura de la glutamina sintetasa humana, muestra los dos anillos pentaméricos cara a cara. El área resaltada en verde representa una de las diez subunidades. Esta figura se creó a partir de PDB 2qc8 utilizando el software UCSF Chimera.
Figura 6, GS humana. Zoom sobre un único sitio activo de GS humano en el que tres iones de manganeso son los centros metálicos, que se muestran en púrpura. Esta figura se creó a partir de PDB 2qc8 utilizando el software UCSF Chimera.
Como se indicó, hay dos iones metálicos en los sitios activos de la GS bacteriana, uno se une con alta afinidad y el otro con baja. El sitio de unión al metal de alta afinidad actúa como cofactor catalítico, representado en azul a continuación, lo que significa que es un ión metálico no proteico que se requiere para la actividad de una enzima. El ion metálico (Mn 2+ ) estabiliza tanto las interacciones electrostáticas como la catálisis ácida de Lewis, proporcionando la estructura del sitio activo y la estabilización de los intermedios para la reacción (Figura 7). El ión metálico de baja afinidad ayuda a estabilizar el sitio activo de GS y a la unión del quelato de Mn-ATP. La reacción general para la síntesis de glutamina a partir de glutamato a través del catalizador GS se muestra arriba (Figura 1). Esta reacción es importante para la absorción de nitrógeno por los compuestos orgánicos porque la glutamina sirve como un bloque de construcción para la biosíntesis de varios metabolitos. El mecanismo para la conversión de glutamato en glutamina se muestra a continuación en la Figura 7.
Figura 7, Mecanismo de glutamato a glutamina. Mecanismo propuesto para la reacción catalizada de glutamato a glutamina. El cofactor catalítico está representado en azul y el ion estabilizador está representado en rosa.
Dado el papel de estos dos iones metálicos, es importante saber más sobre ellos para comprender mejor cómo funciona GS. Ambos iones metálicos tienen un estado de oxidación de +2. Muy a menudo, Mn 2+ es el ion metálico porque GS tiene una afinidad de unión mucho más alta por Mn 2+ (300 – 1000x) que por el magnesio (Mg 2+ ), que tiene la segunda mayor afinidad. Debido a su carga +2, el ion manganeso (número atómico 25) tiene cinco electrones d.
La unión selectiva de Mn 2+ a GS se puede explicar a través de varias teorías. Mientras que otros iones metálicos, incluidos Cd 2+, Mg 2+, Ca 2+, Co 2+ y Zn 2+, se probaron para determinar su afinidad con GS, se descubrió que Mn 2+ es el ión metálico más eficaz, en segundo lugar Mg 2+. Con respecto a la teoría Hard-Soft-Acid-Base (HSAB), tiene sentido que GS se una a Mn 2+iones. HSAB categoriza metales (ácidos) y ligandos (bases) por sus densidades de carga, polarizabilidad y carácter de enlace electrostático o covalente. Cuanto más duro es algo, menos polarizable es. Generalmente, los átomos más duros se asocian con interacciones electrostáticas, que incluyen los metales alcalinos y alcalinotérreos, mientras que los átomos más blandos se asocian más con la polarización y la unión covalente a los ligandos. Hay una regla general a seguir: los ácidos duros prefieren unirse a bases duras y los ácidos blandos prefieren unirse a bases blandas. Mn 2+, Mg 2+, Ca 2+ se clasifican como ácidos duros. Sin embargo, Cd 2+ es un ácido blando y Co 2+ y Zn 2+son ácidos limítrofes. Se predice que los iones metálicos se unen al agua, a un carboxilato de oxígeno en el glutamato y al nitrógeno imidazol en la histidina. Los grupos de donantes de oxígeno se clasifican como bases duras, mientras que el imidazol N está en el límite. Por tanto, este sitio de unión tiene un carácter mixto duro / limítrofe, y la mayoría de los grupos de donantes contribuyen con ligandos de oxígeno duros. Teniendo en cuenta el carácter del sitio de unión, podemos aplicar la teoría HSAB para predecir que los iones de metales duros Mn 2+, Mg 2+, Ca 2+ y Co 2+ serían preferidos en este sitio activo de catión GS sobre metales blandos y limítrofes como Cd 2 + y Zn 2+.
GS requiere un ion metálico que sea geométricamente flexible para que los sustratos puedan unirse y romperse del sitio activo. El ion metálico debe ser capaz de adoptar de tres a cinco geometrías de coordenadas. Co 2+ es un ión metálico, lo que significa que tiene siete electrones en su capa. Teniendo en cuenta la regla de los 18 electrones, se necesitarían cinco o seis ligandos para estar saturados coordinativamente con unos dieciocho electrones (en realidad, diecisiete o diecinueve debido al número impar de electrones d). Además, LFSE causa Co 2+tener preferencia por la geometría octaédrica de seis coordenadas. La estabilización del campo de ligando (LFSE) se define como la energía total de los electrones en relación con la energía promedio de los orbitales. Para los complejos octaédricos, LFSE depende del número de electrones en los orbitales de energía más baja (t 2g ) y los electrones en los orbitales de energía más alta (p. Ej. ) En relación con el baricentro (centro de masa de dos o más cuerpos que orbitan entre sí ). El LFSE de un complejo octaédrico se puede calcular con la siguiente ecuación:
(1)
Donde x es el número de electrones en los orbitales t 2g e y es el número de electrones en los orbitales e g
Por el contrario, Ca 2+ tiene cero electrones d (d 0 ), Mg 2+ tiene cero electrones d (d 0 ) y Mn 2+ tiene cinco electrones d (d 5 ). Estos iones metálicos son más flexibles geométricamente porque todos tienen un LFSE de cero, calculado usando la Ecuación 1. Sin estabilización por LFSE, estos iones no tienen preferencia por una cierta geometría. Por lo tanto, se contentarían con vincularse a las tres o cinco geometrías de coordenadas que están disponibles en el sitio activo de GS. Debido a que el Co 2+ preferiría una geometría octaédrica en lugar de una con solo tres a cinco geometrías de coordenadas, no es un ion metálico ideal para GS. Esto deja tres posibles iones metálicos: Ca 2+, Mg 2+ y Mg 2+. Otro factor que puede influir en el ion metálico preferido por GS es el tamaño atómico de los iones. Ca 2+ tiene un radio iónico de 100 pm, mientras que Mg 2+ tiene un radio iónico de 72 pm y Mn 2+ tiene un radio iónico de 70 pm. Esto explica por qué el Ca 2+ no es el ion metálico preferido; tiene un radio iónico mucho mayor que el de Mg 2+ y Mn 2+. Se prefieren los iones metálicos más pequeños sobre el Ca 2+ más grande. Esto deja dos iones metálicos restantes, Mg 2+ y Mn 2+. Para explicar por qué Mn 2+es el ion metálico preferido para GS en lugar de Mg 2+, consideramos la carga nuclear efectiva (Z eff ) en cada caso. En general, Z eff aumenta a lo largo de las filas de una tabla periódica y hacia abajo en las columnas. Por tanto, Mn 2+ tiene una mayor Z eff que Mg 2+, lo que significa que Mn 2+, con una mayor carga efectiva, se siente más atraído por la densidad electrónica de los ligandos que el Mg 2+. Esto está relacionado con la conocida serie Irving-Williams. En última instancia, tiene sentido que Mn 2+ sea el ión metálico preferido unido al sitio activo de la glutamina sintetasa.
Aunque la geometría del ion metálico manganeso en GS es flexible, cuando está en su coordinación octaédrica, el sistema probablemente sería de alto espín. El estado de alto espín llena cada orbital desocupado con un solo electrón antes de que cualquier orbital se llene con dos electrones; la disposición de energía más baja tiene prioridad. Aunque no está completamente claro, para el propósito de esta discusión, asumimos que Mn 2+ tiene una geometría octaédrica. Hay dos formas en que se puede dibujar el diagrama de división de campo para Mn 2+, en la configuración octaédrica: una para espín alto y otra para espín bajo. Ambos se muestran en la Figura 8 a continuación. Dado que Mn 2+ es un 3d 5metal con una carga +2 y tiene agua como ligando, debe tener un giro alto. Además, el glutamato amino ácidos son donantes pi lo que favorece pequeño delta (la diferencia en energía entre el t 2g y e g en un complejo octaédrico) y de altas revoluciones. La histidina puede ser un aceptor de pi débil, lo que normalmente fomenta el giro bajo, sin embargo, esto no aumentaría el delta lo suficiente como para favorecer el giro bajo. Es importante señalar que una molécula de fosfinotricina (PPT) está unida al ion manganeso de baja afinidad presentado en la Figura 3 anterior. Este es un inhibidor que se introdujo experimentalmente en el sistema, por lo tanto, no siempre está presente en el sistema. Cuando el PPT se une al ion metálico de baja afinidad (rosa n 1 Mn 2+ ), entonces este Mn 2+ion tendría una geometría octaédrica. Cuando el PPT no está unido al ion metálico, existe un sitio de coordinación abierto para que se unan las moléculas de agua o de sustrato.
Figura 8: Diagrama de división de LFSE para Mn 2+. a) representa el diagrama de división de espín alto para un complejo octaédrico, b) representa el diagrama de división de espín bajo para un complejo octaédrico.
Cuando se trata de cinética, la labilidad (o reactividad) se refiere a la velocidad con la que se reemplazan los ligandos en los complejos de coordinación; la rapidez con la que se rompen los enlaces metal-ligando. Hay muchos factores que influyen en si un compuesto es lábil o inerte, incluida la configuración de electrones d, carga, LFSE, tipo de ligando, radio iónico metálico y ocupación orbital antienlazante. Cuanto más LFSE, menos lábil es el ion (menos querrá reaccionar). Esto tiene sentido, porque cuanto mayor es la energía de estabilización del campo del ligando, menos lábil es el metal (porque es más estable), por lo que la molécula es más inerte. Dado que Mn 2+ tiene un LFSE de cero y el e gLos orbitales (orbitales antienlazantes) están ocupados por electrones (configuración de espín alto), se considera que es un ión metálico cinéticamente lábil que, de nuevo, es ventajoso para la unión y liberación ligando / sustrato en GS. En general, los metales con cero LFSE se consideran los más lábiles.
La glutamina sintetasa es un quelante multidentado (un ligando que se une a un metal con más de un átomo). El efecto quelato se considera entrópico, lo que significa que aumenta la entropía (desorden) de una reacción de coordinación y, por lo tanto, aumenta la energía libre de Gibbs. El efecto de quelato se produce tras la unión de un ión metálico a un ligando multidentado; cuantos más átomos utilice el ligando para unirse al metal, más estable será el complejo resultante. GS es un sistema multidentado porque proporciona más de dos grupos de donantes para el Mn 2+iones metálicos para unirse dentro del sitio activo. Más específicamente, es un quelante tridentado, que proporciona ligandos de cadena lateral de tres aminoácidos a cada uno de los iones metálicos. Estos grupos donantes se encuentran en las cadenas laterales de proteínas de las moléculas de glutamato, histidina y agua. Esto ayudaría a explicar por qué GS tiene una alta afinidad por un ion metálico que puede tener múltiples sitios de coordinación.
Esto nos lleva a la reacción catalítica. Como se dijo anteriormente, se cree que la geometría de cada ion metálico es pseudo octaédrica. Cada ion Mn 2+ está unido a tres cadenas laterales de aminoácidos y dos moléculas de agua, en las que una de las moléculas de agua se comparte entre los dos iones metálicos. Se sabe que los ligandos proteicos de Mn 2+ (el cofactor catalítico) son tres aminoácidos glutamato. En cuanto al segundo ion manganeso, con menor afinidad de unión, también tiene ligandos de cadena lateral de tres aminoácidos, dos aminoácidos glutamato y un aminoácido histidina. La geometría pseudo-octaédrica de cinco coordenadas deja al ion metálico con un sitio de coordinación abierto que puede acomodar la unión del ligando. La geometría y el mecanismo de coordinación propuestos se muestran en la Figura 9 a continuación.
Figura 9, Mecanismo catalítico. Primero, el ATP y el glutamato se unen a GS en orden porque la unión de ATP a GS mejora la unión de glutamato (a). En segundo lugar, los dos iones metálicos unidos a enzimas, especialmente el n 2El ion, de color azul, polariza el 7-fosfato de ATP, lo que hace que el átomo de 7-fósforo sea más positivo, lo que promueve que el glutamato ataque y produzca 7-glutamil fosfato. Los dos iones metálicos cargados positivamente y Arg-339 participan en la transferencia de fosforilo (b). En tercer lugar, el movimiento de un aminoácido del ácido aspártico de la subunidad adyacente es inducido por la presencia de ADP, que forma el sitio de unión del ión amonio. La cadena lateral de un ácido aspártico se coloca luego para aceptar un protón del ión amonio unido, formando amoníaco. Esto puede atacar al fosfato de 7-glutamil para producir un intermedio tetraédrico. Este intermedio tetraédrico puede estabilizar residuos formando un enlace de sal a la cadena lateral cargada negativamente de Glu-327 del grupo 7-amino cargado positivamente del intermedio tetraédrico. Esto bloquea la salida del glutamato (c). Finalmente, el grupo fosfato del intermedio tetraédrico transitorio se va, y Glu-327 acepta un protón, muy probablemente del grupo 7-amino del intermedio, para producir glutamina. El nitrógeno amídico de la glutamina se une al hidrógeno n1 de iones, de color rosa, y P i (d). La ausencia de interacción del producto glutamina con Glu-327 libera el segmento flexible, permitiendo que la glutamina se difunda desde el sitio activo y permitiendo que el glutamato entre para el siguiente ciclo catalítico.
Cuando un complejo absorbe luz con una energía correspondiente a delta, un electrón pasa de un orbital d a otro, lo que se conoce como transición dd. Mn 2+ tiene un orbital d parcialmente lleno, d. Por lo tanto, las transiciones dd, o la excitación de electrones dentro de los orbitales “d” (por ejemplo. A partir de t 2g a e g ), pueden ocurrir, que daría lugar a posibles absorciones electrónicos que se pueden observar con UV-vis. Debido a que Mn 2+ es un ion metálico de alto espín, tiene un delta pequeño, lo que significa que es más fácil mover electrones desde t 2g hasta e g. Un pequeño delta es una indicación de luz de baja absorción de energía. También podría haber transiciones electrónicas de transferencia de carga en este complejo metálico porque, si bien no hay ligandos aceptores de pi, existen ligandos donantes de pi. Esto significa que las transferencias de carga pueden ocurrir de ligando a metal (LMCT). Los estudios han demostrado que el valor máximo de absorbancia de Mn 2+ es cuando la longitud de onda de detección es de 553 nm. Si Mn 2+ se absorbe a 553 nm, eso significa que aparece de color púrpura rojizo (magenta).
Actualmente, hay muchos estudios activos que buscan inhibidores de GS. Un inhibidor de GS vegetal (glufosinato) es uno de los herbicidas más utilizados en todo el planeta. Además, se ha demostrado que la GS bacteriana es aplicable en el desarrollo de fármacos contra la tuberculosis y en la terapia del cáncer. 11,12 Todavía hay mucho que aprender sobre GS, incluida información sobre su estructura y geometría, sus propiedades de unión a iones metálicos y sus mecanismos catalíticos y de inhibición.
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