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Western Blot

Definición de Western Blot

Western blot, también conocido como inmunotransferencia, es el proceso de separar proteínas e identificarlas en una muestra biológica compleja.

• El uso de electroforesis en gel de poliacrilamida es un requisito previo para el Western Blot con el fin de separar las proteínas antes de su identificación.
• El proceso de transferencia Western implica la transferencia de proteínas separadas por SDS PAGE a una membrana absorbente. A continuación, las proteínas se pueden identificar en la membrana por diferentes medios.
• El Western Blot ha revolucionado el campo de la inmunología con el uso de sondas de anticuerpos contra proteínas unidas a la membrana.
• La inmunodetección de proteínas tiene una amplia aplicación en bioquímica y otras ciencias, ya que puede detectar y caracterizar multitud de proteínas.
• La sensibilidad del proceso depende de la eficiencia de la retención de transferencia de proteínas durante el procesamiento y la detección final.
• La transferencia Western o transferencia de proteínas depende de la especificidad de la interacción entre la proteína de interés y la sonda utilizada para la detección de la proteína.
• A diferencia de la transferencia Southern que utiliza sondas de ácido nucleico marcadas radiactivamente, la transferencia Western generalmente usa un segundo anticuerpo etiquetado con una enzima.
• La transferencia Western tiene una serie de ventajas sobre otras técnicas similares, ya que el proceso solo requiere el uso de una pequeña cantidad de reactivos y la misma transferencia de proteínas se puede usar para múltiples análisis. 

Principio de Western Blot

• El principio del western blot es la interacción entre las proteínas y las sondas utilizadas para la detección de las proteínas.
• Las proteínas utilizadas para el western blot se separan mediante electroforesis en gel para obtenerlas en una matriz de gel.
• Luego, las proteínas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa o fluoruro de polivinilideno (PVDF), donde se inmovilizan. La transferencia de la proteína se conoce como transferencia.
• La proteína de la membrana puede detectarse mediante el uso de un anticuerpo primario marcado con informador dirigido contra la proteína o un anticuerpo secundario marcado con informador dirigido al anticuerpo primario.
• El indicador o sonda presente en el anticuerpo puede ser una enzima que produce una reacción de color o una señal luminiscente en el sitio de unión antígeno-anticuerpo que produce una señal fluorescente en presencia de un sustrato particular.
• La señal o color generado por la sonda requiere un sistema de detección que sea apropiado para la señal o intensidad generada.

Requisitos para Western Blot

Electroforesis en gel

• Gel (NuPAGE)
• Fuente de alimentación básica
• Tampón de muestra
• Bloque calefactor
• Tampón reductor de muestras
• Escalera de proteínas teñida previamente

Transferencia de Proteínas

• Mini Trans-Blot que consta de tanque, tapa y módulo blot. El conjunto se almacena con hielo refrigerante para que se congele cuando sea necesario.
• Papel de filtro de nitrocelulosa de 0,45 µm
• Tampón de transferencia NuPAGE
• Metanol
• Plato Pyrex cuadrado
• Placa de Petri de plástico desechable cuadrada
• Navaja de afeitar y cuchillo de gel
• Fuente de alimentación básica

Western Blot

• Solución salina tamponada con Tris 10x con Tween 20 al 1%.
• Criba vibradora
• Leche en polvo descremada al 10%
• Placa de Petri de plástico desechable cuadrada
• Bolsas de plastico
• Sellador térmico de impulsos
• Anticuerpo primario
• Anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante contra la especie huésped del anticuerpo primario.
• Sustrato quimioluminiscente
• Sistema de documentación en gel

Procedimiento de Western Blot

El proceso de Western Blot consta de los siguientes pasos;

1. Preparación de la muestra

• Las muestras más comúnmente utilizadas para Western Blot son los lisados ​​celulares que se recogen mediante el proceso de extracción.
• La extracción se puede lograr por diferentes medios como destrucción mecánica, extracción química o el uso de enzimas.
• La extracción de a menudo se realiza a temperatura fría en presencia de inhibidores de proteasa para evitar la desnaturalización de las proteínas.

2. Electroforesis en gel

• La muestra de proteína se diluye con el tampón de muestra y se calienta y agita durante 10 minutos a 70 ° C.
• A continuación, la muestra se centrifuga a 5000 g.
• La caja de gel se saca de la bolsa y se coloca en el tanque de compensación contra el sello de goma con las paredes de gel mirando hacia el interior del depósito del tanque.
• El tampón en funcionamiento se vierte en el depósito superior mientras se asegura que no se produzcan fugas en el depósito inferior.
• Luego, cada uno de los pocillos se carga con un volumen igual de muestra desnaturalizada por calor, y uno de los carriles se reserva para la escalera de proteínas.
• La tapa se coloca en el tanque y se conecta a la fuente de alimentación.
• Se deja que la corrida funcione a 200 V constante durante 50 minutos.

3. Transferencia de proteínas

• El tampón de transferencia se prepara añadiendo metanol al 10% al tampón.
• La caja de transferencia se toma y se coloca. Luego se cubre con un búfer de transferencia.
• Se toma una esponja de espuma y se coloca en la parte posterior, sobre la cual se coloca el papel de filtro. Estos deben colocarse para asegurarse de que ambos estén mojados y ligeramente sumergidos.
• El gel se saca del tanque y se coloca sobre el papel de filtro húmedo. 
• La membrana de nitrocelulosa se humedece con el tampón de transferencia y se coloca encima del gel de manera que no haya burbujas entre el gel y la membrana.
• La caja de transferencia se coloca en el tanque de transferencia, que se llena más con tampón de transferencia.
• Luego, el tanque se conecta a la alimentación a 100 V durante 1 hora.
• Una vez que se completa la transferencia, se retira la caja de transferencia y la membrana de nitrocelulosa se retira del gel.

4. Inmunodetección

• La membrana se lava con solución salina tamponada con Tris durante 5 minutos en una placa de Petri.
• La leche en polvo descremada al 10% se mezcla con el tampón Tris y la membrana se cubre con la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente.
• La membrana se lava con el tampón Tris para eliminar cualquier exceso de mezcla que quede en la membrana.
• Con la ayuda de las pinzas, la membrana se transfiere a una nueva placa de Petri en la que se agrega el anticuerpo primario.
• La membrana con el anticuerpo se incuba durante 3 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, la membrana se lava después de la incubación con el tampón Tris.
• La membrana se transfiere nuevamente a una nueva placa de Petri, donde se agrega un anticuerpo secundario conjugado con HRP. La membrana se incuba durante 1 hora. La concentración de anticuerpos secundarios a menudo permanece en 1 µg / ml, pero esto también depende de la dilución.
• La membrana se lava nuevamente con tampón Tris para eliminar el exceso de anticuerpos de la superficie.
• Se incuba la membrana con el sustrato durante 5 minutos y se realiza la observación.

Interpretación de resultados de Western Blot

• El resultado de la transferencia Western depende del tipo de sondas utilizadas durante el proceso.
• Si se usa un anticuerpo secundario conjugado con enzima, la reacción entre el sustrato y la enzima produce un color.
• El tinte soluble se convierte en una forma insoluble, lo que da como resultado un color diferente en la membrana.
• Para detener el desarrollo de una mancha, el tinte se elimina lavando la membrana.
• A continuación, los niveles de proteínas pueden evaluarse mediante espectrofotometría.

Aplicaciones de Western Blot

1. El Western Blot es un método excelente con una alta sensibilidad para detectar una proteína en particular, incluso en poca cantidad.
2. El Western Blot se ha utilizado en el diagnóstico clínico de diferentes enfermedades. La prueba de confirmación del VIH implica una transferencia de Western mediante la detección de anticuerpos anti-VIH en el suero.
3. La técnica se ha utilizado para cuantificar proteínas y otros productos génicos en estudios de expresión génica.
4. Dado que la transferencia de Western detecta las proteínas por su tamaño y capacidad para unirse al anticuerpo, es apropiado para evaluar las expresiones de proteínas en las células y analizar más las fracciones de proteínas durante la purificación de proteínas.
5. La transferencia Western también se utiliza para el análisis de diferentes biomarcadores como factores de crecimiento, citocinas y hormonas.

Limitaciones de Western Blot

1. Dado que es un proceso muy sensible, cualquier desequilibrio en el proceso puede afectar los resultados de todo el proceso.
2. En algunos casos, no se pueden observar bandas o bandas erróneas debido a la transferencia insuficiente de las proteínas.
3. La prueba solo se puede utilizar como prueba semicuantitativa, ya que la estimación no siempre es precisa.
4. El proceso requiere mucho tiempo y es complejo, por lo que solo puede ser realizado por personal bien capacitado.
5. La transferencia de Western solo se puede realizar para proteínas si los anticuerpos primarios para las proteínas están disponibles.
6. Algunos anticuerpos pueden exhibir efectos fuera del objetivo al interactuar con más de una proteína en la muestra.
7. La técnica es un proceso costoso con el costo de los anticuerpos y los métodos de detección costosos.
8. Es posible que la membrana no retenga las proteínas pequeñas, mientras que las proteínas más grandes son difíciles de transferir a la membrana.

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