¿Qué es la cromatografía?

La cromatografía es de las técnicas de análisis que más se ha conseguido diversificar y aplicar a distintas necesidades; ya que permite separar compuestos por diferencias de estos en propiedades como tamaño, carga, afinidad por una molécula en particular u otra propiedad.

Mijail Tsvet fue un botánico ruso que llevó a cabo la primera cromatografía de forma deliberada; separando pigmentos de plantas en una sencilla columna de carbonato de calcio fino (polvo de tiza). La cromatografía no es, de hecho, una técnica de análisis, sino una técnica de separación; que se puede acoplar a un detector para llevar a cabo un análisis. En la teoría, esta técnica consta de 3 elementos; mezcla de compuestos que se desean separar; la fase móvil que va a consistir en un fluido que circula arrastrando la muestra en disolución a través del tercer elemento y; la fase estacionaria, que puede ser un sólido o un líquido adsorbido sobre la superficie de un sólido. Hasta aquí quizás no imaginamos muy bien como esto logra separar compuestos; o por qué ha llegado a ser una técnica prevalente en el análisis químico.

Bien, veamos una calle por la que circula un grupo de personas, todos partiendo de un mismo punto y al mismo tiempo, de diferentes edades; y pongamos que en esta calle hay muchas tiendas de ropa de deporte; tecnología y pubs, a medida que el grupo avanza por la calle, este será cada vez menos uniforme porque los más jóvenes se entretendrán mirando escaparates y precios; porque tienen afinidad por ese entorno, y sin embargo no dejan de caminar ni entran a comprar nada, mientras que los más mayores son más pasivos y esto no les supone una distracción; simplemente avanzan sin apenas interaccionar con el entorno.

Si la calle es lo suficientemente larga veremos que, al final de esta; el grupo original de gente que partió al principio se ha dividido en grupos de gente que tarda más o menos en cruzar la calle según su edad. Veremos cómo primero pasan los más mayores luego algunos señores adultos que a lo mejor han mirado algún escaparate y por último los más jóvenes que han estado toda la tarde comentando que les gustaría comprarse.

Pues esto es la cromatografía básicamente. La muestra, que sería el grupo inicial, es arrastrada por la fase móvil a través de la fase estacionaria, que sería la calle. Las primeras técnicas cromatográficas consistían en separar compuestos por su capacidad para ser arrastradas por disolventes orgánicos; a través de fases estacionarias consistentes en lechos porosos de sustancias con cierta polaridad; (a esta técnica se le llamaría después de fase normal) estableciendo así un entorno en el que hay 2 zonas distintas; la del disolvente apolar que avanza y la del lecho poroso estático.

Aquí una sustancia fuertemente soluble en el disolvente apenas interaccionaría con la fase estacionaria y sería arrastrada a la misma velocidad a la que avanza el disolvente; y una sustancia fuertemente polar tendría mucha afinidad por la fase estacionaria y se adheriría fuertemente a la superficie de esta, siendo apenas arrastrada por el disolvente y tardando mucho en avanzar. A través de esto, parámetros complejos como la polaridad o hidrofobicidad de una sustancia se pueden simplificar; a priori, en una medida de tiempo, lo que llamamos, tiempo de retención.

Proceso de separación de una cromatografía

 También se pueden aprovechar otras características de las moléculas como su tamaño; (en el caso de la cromatografía de exclusión por tamaño); o la afinidad por un compuesto muy selectivo (en el caso de la cromatografía por afinidad).

Ejemplo de cromatografía

Pongamos ahora un ejemplo para imaginar cómo funciona la exclusión por tamaño, podemos imaginar un camino de campo, de tierra y muy pedregoso. Si al principio de este camino comienzan a andar un grupo de adultos con niños veremos que, a lo largo del camino, los niños; con menor talla de pie, tienen más dificultades para avanzar porque los zapatos se les meten entre las piedras y se les encajan en grietas entre la tierra; mientras que los adultos, al tener mayor talla, pisan una superficie mayor que la de los huecos que hay en la superficie y por esto no se atascan; avanzando así con menor dificultad.

La cromatografía de exclusión por tamaño trabaja de este modo, hay un lecho de partículas sólidas y porosas, como muchas esponjas microscópicas, a través del cual pasa una mezcla de sustancias; de estas las de mayor tamaño no cabrán en las porosidades de las partículas y fluirán fácilmente entre ellas, mientras que las de menor tamaño circularán erráticamente dentro y fuera de las porosidades de las partículas. Con esta técnica sirve tanto para analizar y purificar una molécula como para estimar el tamaño de esta.

Flujo de moléculas en una cromatografía
FlEL flujo de las moléculas más pequeñas es tortuoso y laberíntico mientras que el flujo de las más grande es más directo y acorde al flujo de la fase móvil.

Técnicas como las electroforesis, en las que no se bombea fase móvil; si no que los compuestos son propulsados por un campo eléctrico que les hace migrar desde un polo hacia el contrario según el signo y magnitud de su carga; funcionan justo al revés, no se trata de lechos de partículas, si no de geles; mayas continuas de polímeros como poliacrilamida o agarosa, que permiten más fácilmente el paso a través de sus poros a las moléculas más pequeñas y lo dificulta a las más grandes.

En el caso de la cromatografía de afinidad podríamos imaginar a otro grupo de personas que parten a la vez de un mismo punto al principio de la calle. En esta calle hay señores recogiendo firmas para defender distintas causas y piden a todo el mundo que los apoye. Estos señores no tendrán mucha colaboración a menos que den con alguien muy comprometido con su causa; y esté dispuesto a hacer donaciones periódicas o apoyar algún manifiesto, entonces se detendrán en este punto porque encajan muy bien y no lo abandonarán; hasta que hayan ayudado de forma efectiva a esta causa. Pasado un rato no quedará nadie en la calle de los que comenzó al principio salvo los que están intentando ayudar a los defensores de causas.

En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria está recubierta de sustancias que son capaces de unirse con bastante fuerza a moléculas concretas; como por ejemplo pasa con la cromatografía de afinidad His-Tag; la de biotina o la de anticuerpos ligados, que no retrasan las sustancias por las que tienen afinidad si no que las retienen; en ciertas condiciones de acidez y salinidad, pero estas fuerzas se debilitan cuando el entorno cambia en estos parámetros, permitiendo que abandonen la fase estacionaria.

La biotina por ejemplo es una vitamina fuertemente anclada por la proteína avidina; las proteínas con fragmentos 6His se unen fuertemente al níquel ligado en fases estacionarias y se desliga cuando hay imidazol en el entorno; y los anticuerpos pueden unir moléculas frente a los que tienen afinidad específica. De esta forma se puede aislar un compuesto con gran pureza, ya que dejamos pasar por la columna cualquier sustancia que no sea aquella para la que está diseñada la fase estacionaria y podemos desligar está en el momento oportuno.

Cromatografía de afinidad

Cromatografía de afinidad
de aEn estas 3 etapas, la cromatografía de afinidad consigue retener un compuesto y desligarlo para obtenerlo con gran pureza.
"Cromatografía"
Portada de “The Dark Side of the Moon” de Pink Floyd, en la que encontramos un prisma separando en distintos haces los colores contenidos en un rayo de luz blanca.

¿Qué tiene que ver Pink Floyd en todo esto? Bueno…

Ahora que tenemos una buena técnica para separar sustancias necesitamos otra buena técnica para detectar cuando estas sustancias abandonan la columna; los detectores más comunes se basan en una fuente de luz que atraviesa una cámara; por la que pasa el flujo que sale de la columna y un detector que mide la luz recibida de la fuente. De este modo, cuando el flujo de la columna arrastra una sustancia que absorbe un tipo concreto de luz; el detector percibe esta caída en la intensidad de la luz y la registra.

Captura de pantalla de un celular con letras

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Cómo se detecta

Debemos detenernos un momento aquí para detallar algo sencillo que es muy importante hay muchos tipos distintos de ondas electromagnéticas, entre las cuales está la luz visible, formada por los colores.

A priori, la luz blanca contiene todos los colores que la vista humana puede detectar, pues bien, cada material tiene la propiedad de transmitir la luz de ciertos colores y absorber la de otros; los materiales transparentes transmiten la mayoría de los colores, la clorofila, el pigmento verde de las plantas; absorbe bien la luz azul y la roja transformándola en energía, pero transmite mucho la luz verde, lo que hace que veamos las plantas de este color. Todo lo anterior podría matizarse mucho y se podría ahondar en algunos términos, pero esto sería suficiente para entender el detector.

Esto es importante para entender estos detectores ya que no consisten en un rayo de luz blanca tal cual si no que, de este haz de luz, a través de un cromador, se separan los colores y se selecciona el color que se desea detectar; el que mejor absorba el material que deseamos analizar. Aparte tenemos detectores “la luz que no podemos ver” el ultravioleta y los infrarrojos, que de hecho son mucho más empleados que los de luz visible.

La luz visible está solo en un estrecho rango de todas las radiaciones que conocemos.

Tipos de cromatografías

Aunque aquí se ha hablado principalmente de la cromatografía líquida de alta definición (High Performance Liquid Chromatography o simplemente HPLC) hay muchas variantes de esta, como la cromatografía de gases, la cromatografía líquido-líquido, la cromatografía centrífuga o la cromatografía en capa fina. Esta última es realmente sencilla y accesible además que aún mantiene su vigencia para algunas aplicaciones. Para hacerla en casa, como decíamos al principio, necesitamos 3 elementos, mezcla de compuestos a separar, fase estacionaria y fase móvil.

Cromatografía casera

Nuestra fase estacionaria va a ser un trozo de papel de unos 5 cm de ancho y 20 de largo, aproximadamente; la fase móvil será alcohol de 96º y nuestra mezcla de compuestos será un puntito del papel que impregnaremos de al menos 2 tipos distintos de rotulador de distintos colores ( a veces los rotuladores azules o negros traen ya 2 compuestos distintos); para mejorar el resultado convendría hacer varias aplicaciones rápidas de tinta y dejar el puntito secar entre estas; así tendremos un punto más pequeño y definido que no se ensanchará demasiado en el proceso. Este puntito tendremos que hacerlo a unos 2 cm de uno de los lados cortos de la tira de papel.

Tomamos un tarro con una altura de al menos 10 cm, aunque mejor si son 20, ponemos alcohol en el tarro hasta que haya “un dedo” de líquido. Ahora, con cinta adhesiva, unimos el lado corto contrario al lado donde hemos puesto el punto a un lápiz, por ejemplo. De esta forma podremos poner el lápiz en la boca del tarro para que de este cuelgue nuestra fase estacionaria, aunque antes de esto hay que comprobar un detalle clave, que el punto que hemos aplicado de tinta no estará por debajo del nivel del alcohol cuando lo introduzcamos en el tarro, de lo contrario nuestra muestra se diluiría en el alcohol y no ascendería por capilaridad a lo largo del papel.

Cuando el alcohol alcance el punto de la muestra empezaremos a ver como arrastra está a través del papel; y pocos centímetros después veremos cómo empiezan a verse zonas de distinto color e intensidad. Un truco para que se dé mejor esta técnica es cortar los picos de la parte que se va a sumergir en alcohol; quitando solo dos pequeños triangulitos de los extremos, ya que esto ayudará a que el alcohol fluya más uniformemente en todo el papel. También podemos experimentar con diferentes proporciones de alcohol y agua para ver como distintas polaridades dan lugar a diferentes formas de arrastre de los compuestos de la muestra.

Imagen que contiene interior, tabla, taza, vidrio

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¡Y ya tendríamos nuestra propia cromatografía!

Autor

Martín Perales

Descubre además en nuestro blog que son los anticuerpos monoclonales aquí.

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