La citometría de flujo es una tecnología estándar basada en láser que se utiliza en la detección y medición de características físicas y químicas de células o partículas en una mezcla de fluidos heterogénea.
El uso de la citometría de flujo ha aumentado a lo largo de los años, ya que proporciona un análisis rápido de múltiples características (tanto cualitativas como cuantitativas) de las células.
Las propiedades que pueden medirse mediante este proceso incluyen el tamaño de partícula, la granularidad o complejidad interna y la intensidad de fluorescencia.
Estas características se determinan mediante un sistema de acoplamiento óptico-electrónico que detecta las células basándose en el láser dispersado por las células.
Un citómetro de flujo, a pesar de su nombre, no se ocupa necesariamente de células; se ocupa de las células con bastante frecuencia, pero también puede ocuparse de los cromosomas o moléculas o de muchas otras partículas que pueden estar suspendidas en un líquido.
Principio de citometría de flujo
El principio básico de la citometría de flujo se basa en la medición de la luz dispersada por partículas y la fluorescencia observada cuando estas partículas pasan en una corriente a través de un rayo láser.
Figura: Esquema de un citómetro de flujo común, que ilustra los sistemas fluídico, óptico y electrónico.
Dispersión de la luz
La dispersión de la luz se produce cuando una partícula desvía la luz del láser incidente. La medida en que esto sucede depende de las propiedades físicas de una partícula, a saber, su tamaño y complejidad interna.
La luz de dispersión frontal (FSC) es proporcional al área de superficie celular o al tamaño de la celda. Es una medida de luz en su mayoría difractada y detecta rayos que están justo fuera del eje del rayo láser incidente dispersado en la dirección de avance por un fotodiodo.
La luz de dispersión lateral (SSC) indica la granularidad celular o la complejidad interna de las células. El SSC es una medida de luz reflejada y refractada mayoritariamente que se produce en cualquier interfaz dentro de la celda donde hay un cambio en el índice de refracción.
Las mediciones de FSC y SSC se utilizan para la diferenciación de tipos de células en una población celular heterogénea.
Fluorescencia
Marcadores fluorescentes utilizados para detectar la expresión de moléculas celulares como proteínas o ácidos nucleicos en un sistema.
El compuesto fluorescente absorbe energía luminosa en un rango de longitudes de onda que es característico de ese compuesto.
Esta absorción de luz hace que un electrón en el compuesto fluorescente se eleve a un nivel de energía más alto.
El electrón excitado decae rápidamente a su estado fundamental, emitiendo el exceso de energía en forma de fluorescencia que luego es recolectada por los detectores.
En una población mixta de células, se pueden usar diferentes fluorocromos para distinguir subpoblaciones separadas.
El patrón de fluorescencia de cada subpoblación, combinado con los datos de FSC y SSC, se puede utilizar para identificar qué células están presentes en una muestra y contar sus porcentajes relativos.
Luego, el sistema electrónico convierte las señales de luz detectadas en señales electrónicas que pueden ser procesadas por la computadora.
Instrumentación / Partes de la citometría de flujo
Un citómetro de flujo se compone de tres sistemas principales: fluido, sistema óptico y sistema electrónico.
Fluidos
El propósito del sistema de fluídica es transportar partículas en una corriente de fluido al rayo láser. Para lograr esto, la muestra se inyecta en una corriente de fluido envolvente (generalmente una solución salina tamponada) dentro de la cámara de flujo.
El diseño de la cámara de flujo permite que el núcleo de la muestra se enfoque en el centro del fluido de la vaina donde el rayo láser interactúa con las partículas.
El enfoque se logra inyectando la suspensión de la muestra en el centro de una corriente de líquido envolvente. El flujo del fluido de la envoltura mueve las partículas y las restringe al centro del núcleo de la muestra.
Sistema óptico
El sistema óptico del citómetro consta de una óptica de excitación y una óptica de recogida.
La óptica de excitación consta del láser y lentes que se utilizan para dar forma y enfocar el rayo láser al flujo de la muestra.
La óptica de recolección consiste en una lente de recolección para recolectar la luz emitida después de que la partícula interactúa con el rayo láser y un sistema de espejos ópticos que desvían las longitudes de onda especificadas de la luz recolectada a detectores ópticos designados.
Después de que una célula o partícula pasa a través de la luz láser, los rayos emitidos en el costado y las señales de fluorescencia se dirigen a los tubos fotomultiplicadores (PMT), y un fotodiodo recoge las señales.
Para lograr la especificidad de un detector para un tinte fluorescente en particular, se coloca un filtro frente a los tubos, lo que permite que solo un rango estrecho de longitudes de onda llegue al detector.
Sistema electronico
El sistema electrónico convierte las señales de los detectores en señales digitales que pueden ser leídas por una computadora.
Una vez que las señales de luz inciden en un lado del PMT o del fotodiodo, se convierten en un número relativo de electrones que se multiplican para crear una corriente eléctrica más significativa.
La corriente eléctrica pasa al amplificador y se convierte en un pulso de voltaje.
El punto más alto del pulso se logra cuando la partícula golpea el centro del haz, en cuyo caso se logra la máxima cantidad de dispersión o fluorescencia.
El convertidor de analógico a digital (ADC) luego convierte el pulso en un número digital.
Protocolo / Procedimiento / Proceso / Pasos de la citometría de flujo
El proceso de citometría de flujo consta de lo siguiente:
Preparación de la muestra
Antes de funcionar en los citómetros de flujo, las células bajo análisis deben estar en suspensión unicelular.
Las células en cultivo agrupadas o las células presentes en órganos sólidos deben convertirse primero en una suspensión de una sola célula antes del análisis mediante digestión enzimática o disociación mecánica del tejido, respectivamente.
Luego le sigue una filtración mecánica para evitar obstrucciones no deseadas del instrumento y obtener datos de flujo de mayor calidad.
A continuación, las células resultantes se incuban en tubos de ensayo o placas de microtitulación con anticuerpos no marcados o conjugados con fluorescencia y se analizan a través de la máquina de citómetro de flujo.
Tinción de anticuerpos
Una vez que se prepara la muestra, las células se recubren con anticuerpos conjugados con fluorocromo específicos para los marcadores de superficie presentes en diferentes células. Esto se puede realizar mediante tinción directa, indirecta o intracelular.
Tinción indirecta, las células se incuban con un anticuerpo conjugado directamente con un fluoróforo.
En la tinción indirecta, el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo detecta el anticuerpo primario
El procedimiento de tinción intracelular permite la medición directa de los antígenos presentes dentro del citoplasma o núcleo celular. Para ello, las células primero se vuelven permeables y luego se tiñen con anticuerpos en el tampón de permeabilización.
Ejecución de muestras
Al principio, se procesan muestras de control para ajustar los voltajes en los detectores.
Se establecen las velocidades de flujo en el citómetro y se procesa la muestra.
Tipos de citometría de flujo
Existen diferentes tipos de citómetros de flujo según el propósito y la precisión del proceso:
Citómetros de flujo tradicionales
Los citómetros tradicionales son el citómetro común que usa fluido envolvente para enfocar la corriente de la muestra.
Los láseres más comunes utilizados en los citómetros de flujo tradicionales son 488 nm (azul), 405 nm (violeta), 532 nm (verde), 552 nm (verde), 561 nm (verde-amarillo), 640 nm (rojo) y 355 nm (ultravioleta).
Citómetros de enfoque acústico
En estos citómetros, se utilizan ondas ultrasónicas para enfocar las células para su análisis.
Esto evita la obstrucción de la muestra y también permite mayores entradas de muestra.
Clasificadores de células
Los clasificadores de células son una categoría de citómetros de flujo tradicionales que permiten al usuario recolectar muestras después del procesamiento.
Las celdas que son positivas para el parámetro deseado se pueden separar de las que son negativas para los parámetros.
Citómetro de flujo de imágenes
Los citómetros de imágenes son citómetros tradicionales combinados con microscopía de fluorescencia.
El citómetro de imágenes permite un análisis rápido de una muestra para determinar la morfología y la fluorescencia de múltiples parámetros tanto a nivel de una sola célula como de una población.
Aplicaciones / Usos
La citometría de flujo se utiliza en varios campos que incluyen biología molecular, patología, inmunología, virología, biología vegetal y biología marina. Algunas de las aplicaciones comunes incluyen:
Se utiliza en laboratorios clínicos para la detección de malignidad en fluidos corporales como la leucemia.
Los citómetros, como los clasificadores de células, se pueden utilizar para separar físicamente las células de interés en tubos de recogida separados.
Puede utilizarse para la detección del contenido de ADN mediante el uso de marcadores fluorescentes.
Los citómetros de flujo permiten el análisis de células de replicación mediante el uso de colorante fluorescente para cuatro etapas diferentes del ciclo celular.
Los citómetros de flujo acústicos se utilizan en el estudio de bacterias resistentes a múltiples fármacos en la sangre y otras muestras.
Pueden detectar las diferentes etapas de muerte celular, apoptosis y necrosis en función de las diferencias en los cambios morfológicos y bioquímicos.
Limitaciones
Este proceso no proporciona información sobre la ubicación o distribución intracelular de proteínas.
Con el tiempo, se acumulan escombros, lo que puede dar lugar a resultados falsos.
El pretratamiento asociado con la preparación de muestras y la tinción es un proceso que requiere mucho tiempo.
La citometría de flujo es un proceso costoso que requiere técnicos altamente calificados.
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